编者按：作为全球血液肿瘤领域最为瞩目的盛典，每年的ASH年会都吸引了来自各国的血液科专家共聚一堂，交流最新的前沿学术成果。而今年可谓是“CAR-T”大年，许多药企和研究所都相继推出了各自的CAR-T产品。但众所周知的是，CAR-T治疗过程中最大的难点在于CRS（细胞因子释放综合征），而如何有效地进行监控这一不良反应一直是需要突破的瓶颈之一。一篇来自北京陆道培血液医院的关于利用流式细胞术检测的方法动态检测CRS的报告入围了本届ASH口头报告。《肿瘤瞭望》特邀本文作者北京陆道培血液医院王东出教授为我们进行解答一些关于本研究的热点问题。
#200.Detecting 24 Kinds of Cytokines Via Flow Cytometry Aimplex Kit Is an Effective Way to Monitor CRS after CAR-T Cells Infusion
(通过FCM试剂盒Aimplex检测24种细胞因子监测CAR-T细胞输注后CRS情况)
细胞因子释放综合征(CRS)是CAR-T最常见的不良反应。有效的细胞因子监测可为早期防治提供支持。随着越来越多有前景的生物标志物被确定与CRS反应相关，Aimplex试剂盒是一种基于流式细胞术(FCM)和微珠的高通量新技术，已被证明是监测外周血(PB)样本中多种细胞因子的有效途径。
本研究通过研究细胞因子与活化细胞的关系，我们可以研究CRS的机制，探索更多的相关标志物。
设计两管组检测24种细胞因子，包括IFN-γ/IL-1β/IL-2/IL-4/IL-5/IL-6/IL-8/IL-10/IL-12p70/IL-17A/IL-17F/IL-22/TNF-α/TNF-β、sCD25/GM-CSF/IL-15/MCP-1/GranzymeB/Reg3A/ST2/TNFRSF1A/Elafin/MIP-1α。检测50例未经CAR-T治疗的完全缓解(CR)患者的PB样本作为正常对照，建立24种细胞因子的正常值。选取2020年1-6月在河北燕达陆道培医院输注CAR-T细胞的患者81例。分别于输注后0d、4d、7d、11d、15d、20d和30d采集血清，FCM Aimplex法检测24种细胞因子。其中选择31例患者通过检测IL-6、IFN-γ、TNF-α和sCD25四种常规细胞因子进行FCM与ELISA的方法学比较。66例患者根据临床表现分为2组，60例无或轻度CRS归为低级别CRS组，6例2级或3级CRS归为高级别CRS组。
ELISA和Aimplex试剂盒的结果趋近于一致，两类试剂盒检测后均显示出CAR-T治疗后PBs的时间-细胞因子变异曲线相似。
高CRS分级组IL-2、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、MCP-1、ST-2s、IL-5、IL-6和IFN-γ的浓度明显增高。通过比较CD3 + 细胞中CAR-T +、CD8 + 和CD4 + T细胞的比例和PB标本中细胞因子的浓度，CAR-T +、CD8 + T细胞的百分比与大多数细胞因子之间存在明显的正相关，CD4 + T细胞的百分比与大多数细胞因子之间存在明显的负相关。
用Aimplex试剂盒检测进行接受CAR-T治疗的患者相关24种细胞因子水平的检测是一种省时、高效的方法，能有效地反映CAR-T治疗后患者PBs中的细胞因子情况。将有助于CAR-T治疗后副作用的监测、早期预防和控制。
肿瘤瞭望：本次大会上您介绍一种新的检测试剂盒，您能否介绍下与传统LUMINEX平台有何区别？
王东出教授：我们都知道CRS作为CAR-T最常见的副作用通过有效的细胞因子监测可以进行早期预防和治疗。随着越来越多的与CRS反应相关联的指标的确认，传统的ELISA检测法由于无法同时检测多种细胞因子，而且所需样本量大、灵活性低、并受到时间和经济成本限制等原因，导致难以满足现有的临床需求。
QBplex kit(原Aimplex kit)是一种基于流式细胞术和微球技术相结合的高通量检测方法，已经被证实是一种有效地检测CAR-T患者外周血标本中多种细胞因子浓度的方法。新的检测方法可以用于观察多种细胞因子表达水平与CAR-T治疗后患者临床症状之间的相关性，希望可以通过血清细胞因子的变化明确细胞因子相关来源细胞，有助于解决和预防CRS等临床问题，同时可以深入研究CRS反应机理和探索更多相关标志物，最终建立CAR-T后细胞因子数据库。
常见的高通量的检测方法主要一个基于LUMINEX平台，一个基于流式平台。ELISA法一直被认为是行业的一种标准，我们原来针对CAR-T回输后患者体内细胞因子变化的检测项目只包含了IL-6，IL-10，IFN-r和sCD25。
之所以我们要用流式来替代传统的ELISA方法。首先，随着越来越多的因子被报道，ELISA的实验要求就变成了在检测细胞因子时的限制。比如BLOOD上曾经报道过IL-1beta和MCP-1与细胞因子风暴有关，还有就是随着合作的生物公司提出的类似IL-2，IL-15等与CAR-T体内激活扩增相关的细胞因子的监测的需求。为了满足日益增长的需求，就需要使用新的高通量的检测方法来满足临床的需求。
王东出教授：在设计试剂盒的时候，选取的24种细胞因子都时患者接受CAR-T疗法和桥接移植后可能出现的GVHD的各种标志物。可以监测患者从回输CAR-T前到移植后免疫重建后的整个过程。
其次，与ELISA法所需要更大的样本用量（50ul-200ul）不同的是，在面对一些体积比较小，获取比较困难的标本的问题会显得尤为重要。且ELISA的方法灵活度低，添加新的标志物等于多一种试剂盒，多一次重复性的操作，最重要的是很难做到同时检测多种细胞因子。
我们现在使用的流式与微球结合的试剂盒是北京旷博生物的QBplex（原Aimplex）。QBplex可有效地检测血清，脑脊液等标本中的细胞因子。对于标本要求更宽泛，抛开明显的高通量检测不谈，其显著的有点之一便是标本用量很少，22.5-45ul一般就足够检测其次对于一部分CAR-T患者会出现中枢神经反应的情况，那么检测脑脊液中的细胞因子就需要被优先考虑了，在检测同样数量的细胞因子的情况下，ELISA需求的样本量远远大于临床可以提供的量。相对于LUMINEX平台，由于QBPlex基于流式平台，而流式细胞仪在各个医院都普遍应用，从转换方法的成本来看，QBPlex也更有优势。
肿瘤瞭望：与传统ELISA法方法相比，新试剂盒的检测准确度如何？
王东出教授：这次的研究中，我们做了ELISA法与QBplex之间的方法学的对比，最直观的结果就是两种方法所检测的结果的趋势是一致的，不管是高值区域还是低值区域。同时检测24种细胞因子的结果展示了新方法在同时检测多种细胞因子，追踪不同时间点的细胞因子体内变化曲线等方面的能力，同时展示了高CRS组和低CRS组之间细胞因子浓度确实存在着明显的差异。为以后大数据库的建立提供了有力的保证。
在检测CRS反应方面，这种检测技术，可以定量的检测送检样本中的24种细胞因子。检测结果不仅可以直观的把患者引起患者临床症状的因素转化为数字，明确患者体内的微环境。其次就是可以指导临床用药，比如托珠单抗这种广泛应用的IL-6受体的使用时机，而且由于高通量检测可以覆盖多种细胞因子，临床在选择靶向药物的时候可以更加精准。同时数据化监测患者体内细胞因子变化，可以直观反映出所用靶向药物是否起到应有的疗效。由于细胞因子是由不同的细胞激活后释放出来的，所以某一种或者几种特定细胞因子的升高，也表明了患者体内某些细胞亚群的激活，也为以特定亚群为靶标的靶向药使用更加精准。大数据分析患者回输前后细胞因子变化曲线，也可以指导临床提前在CAR-T后CRS反应发生前，通过观测特定细胞因子的升高程度来预测病程发展，提前预防CRS或者CRES的发生。
肿瘤瞭望：您认为目前对于CRS的动态检测还存在哪一些问题？
王东出教授：现行的CRS等不良反应的评判标准存在差异，目前的评判还是主要基于一些临床表现，如发热，器官损伤，血氧浓度，肌酐等。
这项关于细胞因子的定量检测的研究其实有希望可以作为一个更直观，并且可以量化的一个指标来评估患者CAR-T后的不良反应。
既往像Carl June在新英格兰上发表的名为《细胞因子风暴》的文章中就指出细胞因子风暴可由CAR-T引发，也可能由HLH等自身免疫疾病引发，免疫系统会过度活化，产生大量炎症性细胞因子、趋化因子等。王福生院士发表的新冠病毒的文章中也有提及细胞因子风暴对患者的影响。
所以如果想要系统全面的监控患者回输CAR-T后CRS的反应，最需要努力去达成的，就是检验科室与临床科室的信息传递，加强之间的交流，患者有没有其他病症或者接受过其他治疗可能在CAR-T扩增的同时引起细胞因子的升高，排除这些背景因素的干扰，可以更准确的去判断CAR-T后的不良反应的情况。
本科及硕士毕业于英国格林威治大学，并获得生物医学和生物技术学位，曾参与人类基因组课题相关工作，主要研究方向为医药学重组蛋白的生产、分析和追踪，包括通过内吞作用对反义药物胞内运输追踪的研究。
2017年加入河北燕达陆道培医院以来，主要从事检验与免疫治疗临床实验检测工作，致力于针对血液病的免疫治疗与检验新方法的研究，研究成果曾在EHA2020会议进行报告和交流，拥有多种细胞免疫治疗临床实验相关的检测经验，包括单双标CAR-T、TCR-T、NK/CIK等细胞疗法的体内细胞扩增和细胞因子水平变化的检验与追踪工作，近期工作主要集中在基于CBA技术的高通量流式细胞术检测24种细胞因子在免疫治疗临床实验和血液病治疗与移植中的应用。